ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ИНДУКЦИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК in vitro (01.06.2009)

Автор: Волкова Татьяна Олеговна

Повышение активности каспаз Усиление флуоресценции Снижение

[NAD++NADH]i

Каспаза-9 Каспазы 3, -7, - 10 ДАФИ БЭ

0,1 % ++ + ? + ? ? ?

0,5 % ++ + ? + ? ? ?

1,5 % ++ ++ + ++ + + ++

ТИМИДИН 2 мМ ++ ++ + ++ + + +

ТИМИДИН + ДМСО 2 мМ+

0,1 % ? + + ? + ? ?

БУТИРАТ

НАТРИЯ 2 мМ ++ ++ + ++ + + +

БУТИРАТ НАТРИЯ + ДМСО 2 мМ+

0,1 % ? ? +

Примечание – В таблице приведены показатели клеток, обработанных реагентами в течение 4-х суток; клетки К562, обработанные одиночными реагентами, сравнивали с необработанными К562; при оценке влияния на процессы комбинаций реагентов сравнение проводили по отношению к первому составляющему комбинации; “+” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,05); “++” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,01); “–” изменение исследуемого показателя отсутствует

Исследуемые соединения (одиночно и в сочетании) обладали выраженным антипролиферативным эффектом на клетки К562. При обработке клеток ДМСО наблюдалось дозо-зависимое повышение синтеза гемоглобина. Эритроидная дифференцировка и увеличение активности каспаз-3, -7, -10 могли не сопровождаться фрагментацией ДНК (см. варианты обработки 0,1 % и 0,5 % ДМСО). Апоптоз в этих вариантах регистрировался на 5–6-е сутки. В культурах, обработанных 1,5 % ДМСО или комбинацией ДМСО с тимидином (бутиратом натрия), индукция эритроидной дифференцировки сопровождалась почти одновременным запуском апоптотических процессов, при этом активировалась каспаза-9. Возможно, в данном случае запуск апоптоза связан с возросшим токсическим эффектом сочетанного действия реагентов на клетки. Следует отметить, что при обработке клеток комбинацией тимидин+ДМСО наблюдался более интенсивный синтез гемоглобина по сравнению с тимидин-обработанными клетками. При замене тимидина на бутират подобного эффекта не регистрировалось.

Таким образом, рассмотренные группы химических реагентов индуцировали дозо- и время-зависимую эритроидную дифференцировку и/или апоптоз клеток К562. При инкубации клеток с комбинациями соединений в модулировании процессов имели место синергический или антагонистический эффекты. Наиболее выраженным дифференцирующим действием обладала комбинация тимидин+ДМСО, апоптоз-индуцирующим – бутират натрия+ДМСО.

1.4. Влияние кортикостероидов и их комбинаций с эритроидными индукторами на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.

В ряде работ показано, что используемые в терапии лейкозов кортикостероиды (глюкокортикоиды) способны индуцировать дифференцировку и апоптоз опухолевых клеток (Анисимов и др., 2001; Nakamaki et al., 1989; Yuksel et al., 2002). Реагенты имеют внутриклеточный рецептор связывания, ассоциированный с гетерогенными ядерными РНП, который, являясь лиганд-зависимым транскрипционным фактором, способен изменять активность генов, связываясь с их респонсивными элементами, либо взаимодействуя с другими транскрипционными факторами или белками-коактиваторами (Eggert et al., 1997). Кроме того, реагенты способны модулировать активность Ca2+-зависимых ферментов (Куцый и др., 1999). Нами проведены исследования по влиянию на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток К562 гидрокортизона, преднизолона, дексаметазона и их комбинаций с эритроидными индукторами.

Рис. 3. Концентрация гемоглобина в клетках К562, обработанных кортикостероидами в течение 4-х суток

1 – необработанные индукторами клетки (контроль); 2 – клетки, культивируемые с гидрокортизоном; 3 – с преднизолоном; 4 – с дексметазоном; концентрация реагентов – 10 мкМ; * достоверное отличие от контроля (р<0,05)

Из результатов следует, что гидрокортизон и преднизолон не модулировали эритроидную дифференцировку и апоптоз клеток (рис. 3, табл. 4). Напротив, дексаметазон подавлял синтез гемоглобина, стимулировал экспрессию CD11b, CD14 и CD41-антигенов (табл. 3) и фрагментацию ДНК клеток (табл. 4). При одновременном внесении в среду 5 мкМ дексаметазона и 2 мМ тимидина (или бутирата) параметры флуоресценции БЭ и ДАФИ при связывании с ДНК резко возрастали, активировались каспазы--3, -7, -9, -10. Аналогичный эффект имел место также при замене дексаметазона на преднизолон или гидрокортизон.

Таким образом, кортикостероиды способны индуцировать миелоцитарную дифференцировку клеток К562. Повышенная активация каспаз-9 и -3, -7, -10, а также выраженная фрагментация ДНК клеток, обработанных

Таблица 3

Процент клеток К562, экспрессирующих CD11b, CD14 и CD41-антигены,

после инкубации с кортикостероидами в течение 4-х суток

РЕАГЕНТ CD11b+-клетки, % CD14+-клетки, % CD41+-клетки, %

Контроль 24,4±1,3 36,3(1,9 11,7(1,8

Гидрокортизон 25,7±1,9 38,1(1,7 11,9(1,5

Преднизолон 29,2±1,6* 38,9(2,1 14,8(2,7

Дексаметазон 34,7±1,8* 45,8(1,7* 19,8(1,6*

Примечание – Концентрация реагентов – 10 мкМ; * достоверное отличие от контроля (р<0,05)

Таблица 4

Параметры (ДАФИ и (БЭ флуоресценции нуклеоидов клеток К562,

обработанных кортикостероидами в течение 4-х суток

РЕАГЕНТ (ДАФИ (БЭ

Контроль 36,90(0,07 6,20(0,10

Дексаметазон (10 мкМ) 48,07(0,08* 9,28(0,02*

Преднизолон (10 мкМ) 37,02(0,12 6,53(0,09

Гидрокортизон (10 мкМ) 36,92(0,13 6,40(0,08

Примечание – Клетки инкубировали в 96-луночных микропланшетах по 0,02 млн. клеток/лунку; показатели (ДАФИ и (БЭ для тимоцитов, обработанных 5 мкМ дексаметазона в течение 6 час: 47,86(0,34* и 9,14(0,18* (необработанные клетки: 40,81(0,22 и 6,83(0,34, соответственно); * достоверное отличие от контроля (р<0,05)


загрузка...