Патофизиологические механизмы формирования хронической обструктивной болезни легких (клинико-экспериментальное исследование) (01.06.2009)

Автор: Кузубова Наталия Анатольевна

Воспроизведение ХОБЛ в эксперименте. Исследование роли региональной нервной системы легких в формировании ХОБЛ. Для воспроизведения ХОБЛ в эксперименте крыс на протяжении 60-90 дней ежедневно в течение 1,5 часов подвергали ингаляционному воздействию NO2 (30-40 мг/м3). Формирование изменений, соответствующих ХОБЛ, подтверждено результатами гистологических, морфометрических, иммуногистохимических и иммунологических исследований (решение о выдаче патента «Способ моделирования хронической обструктивной болезни легких» 19.02.09; заявка № 2008111053 от 25.03.08). Исследование роли нейрогенных механизмов в развитии хронического воспаления и бронхообструктивного синдрома проводили на изолированных препаратах бронхов крыс на разных сроках воспроизведения ХОБЛ (15, 30, 60 и 90 дней воздействия NO2) с использованием методик стимулирования электрическим полем различных звеньев функционального модуля ДП и фармакологической блокады рецепторного аппарата бронхов. Опыты проводили на сегментах бронхов 2-6 порядка с участком бифуркации, где располагаются интрамуральные ганглии. Сокращение ГМ бронха регистрировали электромеханическим датчиком смещений. Оценивали сократительную реакцию ГМ на контрольную стимуляцию (клинический эквивалент – обычная физическая нагрузка) и дополнительную стимуляцию (клинический эквивалент – повышенная физическая нагрузка).

Препараты бронхов крыс, подвергнутых воздействию NO2 в течение 15-60 дней (период формирования ХОБЛ), отвечали усилением сократительной активности ГМ на контрольную стимуляцию преганглионарных нервов (ПГН) и практически не реагировали на раздражение самой ГМ. На этапе дальнейшего прогрессирования ХОБЛ (90 дней NO2) активность ГМ бронхов снижалась при стимуляции как ПГН, так и ГМ, задерживалось начало сократительной реакции, что могло быть следствием ухудшения функционального состояния ГМ. Амплитуда сокращения ГМ бронхов в ответ на дополнительную стимуляцию ПГН увеличивалась на 13-17 % в сравнении с контрольной стимуляцией (рис. 17). После 60-90 дней воздействия NO2 при дополнительной стимуляции самой ГМ отмечалось уменьшение амплитуды ее сокращения (рис. 17).

Рис. 17. Амплитуда сокращения ГМ препаратов бронхов в ответ на дополнительную стимуляцию ПГН (ст. нервов) и ГМ (ст. мышцы). Рис. 18. Амплитуда сокращения ГМ бронхов после 15-дневной экспозиции NO2 в ответ на серию дополнительных стимуляций преганглионарных (пре) и постганглионарных (пост) нервов и ГМ (мышца).

Усиление сокращения ГМ бронхов в ответ на дополнительную стимуляцию ПГН могло быть связано с функцией либо сенсорного звена, либо нейронов функционального модуля. Был проведен анализ сократительной реакции ГМ на длительное раздражение ПГН, постганглионарных нервов и ГМ (рис. 18). После 15 дней воздействия NO2 амплитуда сокращения ГМ бронхов возрастала с каждой последующей стимуляцией ПГН, максимальный прирост составил 32 %. При стимуляции постганглионарных нервов увеличение амплитуды сокращений ГМ на 12 % достигалось уже при 2-й стимуляции, после чего величина ответа ГМ бронхов стабилизировалась. При стимуляции ГМ амплитуда ее сокращения не изменялась. Таким образом, воздействие NO2 уже к 15 дню приводило к нарушению функции как афферентного, так и эфферентного звена функционального модуля ДП (мускариновых М2-рецепторов постганглионарных холинергических волокон), а на более поздней стадии (60 дней) – к снижению сократительной активности самой ГМ.

Диоксид азота, как и любой аэрогенный поллютант, в первую очередь, взаимодействует с эпителием и рецепторами бронхов. Рецепторный аппарат эпителия ДП представлен быстроадаптирующимися рецепторами, которые реагируют в основном на скорость воздушного потока, и капсаицин-чувствительными окончаниями С-волокон, реагирующими на химические вещества, в частности, поллютанты. Механизм действия капсаицина на С-волокна заключается в деполяризации мембраны и повышении проводимости катионных каналов, что ведет к внутриклеточному накоплению Са2+ и выделению нейромедиаторов (тахикининов) из терминалей С-волокон и, как следствие, к их десенситизации. Для инактивации нервных окончаний С-волокон крысам подкожно вводили капсаицин (1 мг/кг), после чего в течение 15 дней подвергали воздействию NO2. Это приводило к снижению амплитуды сокращения ГМ бронхов как при контрольной, так и дополнительной стимуляции ПГН и ГМ относительно величины сокращений ГМ бронхов крыс, которые подвергались воздействию NO2 без введения капсаицина (рис. 19). Такие ответы ГМ бронхов были характерны для препаратов бронхов крыс, ингалированных NO2 60-90 дней. Вероятно, NO2 и капсаицин действовали на одно и тоже звено, а именно на чувствительные окончания С-волокон.

Влияние КС на сократительную активность бронхов в процессе формирования ХОБЛ. На этапах формирования ХОБЛ оценивали влияние преднизолона (П) на сократительную активность ГМ бронхов. П добавляли в перфузат, в котором находились препараты бронхов. Наибольший дилатационный эффект КС проявлялся на острой стадии процесса (15 дней NO2): П в концентрации 1 мкг/мл снижал амплитуду сокращения ГМ бронхов, вызванную дополнительной стимуляцией ПГН, на 22,4±1,4 % (р<0,01), а в концентрации 10 мкг/мл – на 29,4±2,5% (р<0,01).

Рис. 20. Влияние преднизолона (10 мкг/ мл) на сократительный ответ ГМ брон-хов, вызванный дополнительной стиму-ляцией ПГН, в условиях новокаиновой блокады бронхиальных рецепторов.

После 30 дней воздействия NO2 дилатационное влияние П уменьшалось, а при 60- и 90-дневной экспозиции эффект П отсутствовал, вероятнее всего, из-за снижения чувствительности препаратов бронхов к КС.

При стимуляции ГМ введение П не влияло на амплитуду сокращения ГМ бронхов после всех сроков воздействия NO2. Это означает, что дилатационный эффект КС связан, главным образом, с нейрональными структурами ДП (нейронами функционального модуля и/или их рецепторами), которые инактивируются при длительном воздействии NO2. Блокада рецепторного аппарата ДП новокаином приводила к снижению дилатационного эффекта П, что проявлялось в меньшем (17,6±6,0 %), чем до обработки новокаином (27,7±2,5 %) снижении амплитуды сокращения ГМ бронхов в ответ на стимуляцию ПГН. При удлинении воздействия NO2 до 30 дней новокаин полностью нивелировал дилатационный эффект П, а после 60 и 90 дней КС вместо снижения вызывал усиление сократительных ответов ГМ бронхов – на 25,2±5,6 % и 19,9±5,0 % соответственно (рис. 20). Этот эффект проявлялся при стимуляции как ПГН, так и ГМ. Т.о., точкой приложения действия NO2 и КС служат одни и те же нервные структуры – рецепторы афферентных нейронов функционального модуля легких. Подтверждение этому было получено при исследовании эффекта П на препараты бронхов крыс, подвергавшихся воздействию NO2 в условиях инактивации афферентных С-волокон капсаицином. ГМ препаратов бронхов этих крыс не реагировали на введение в перфузат П при стимуляции как ПГН, так и ГМ. Итак, инактивация нервных окончаний афферентных С-волокон капсаицином полностью предотвращала расслабляющий эффект КС на ГМ бронхов. Этот факт послужил основанием считать, что капсаицин и КС взаимодействовали с одними и теми же структурами бронхов – капсаицин-чувствительными афферентными С-волокнами. Рефрактерность ГМ бронхов к КС, вероятно, была обусловлена инактивацией С-волокон в результате длительного воздействия NO2. Применение в течение месяца КС-препарата БДП у крыс с ХОБЛ улучшало сократительную способность ГМ бронхов, но не сказывалось на функциональном состоянии нервного аппарата бронхов.

Помимо бронхолитического действия, взаимодействие КС с окончаниями С-волокон способствует развитию ПВ эффекта, так как эти нервные структуры инициируют нейрогенное воспаление. Чувствительные окончания С-волокон выполняют не только афферентную, но и местную эффекторную функцию. В везикулах терминалей С-волокон содержатся нейропептиды, которые при стимуляции нервных окончаний химическими факторами выделяются экзоцитозом и транспортируются не только в центральном, но преимущественно в периферическом направлении. В связи с этим местную эффекторную функцию чувствительных С-терминалей и их роль в инициации нейрогенного воспаления можно представить следующим образом. Под влиянием поллютантов (NO2) активируются терминали С-волокон и выделяются содержащиеся в них нейромедиаторы (тахикинины и KGRP). Диффундируя в окружающие ткани, они оказывают влияние на ГМ дыхательных путей, МЦ сеть и секреторные железы, приводя к развитию бронхоспазма и гиперреактивности ГМ бронхов, экстравазации и гиперсекреции слизи [Barnes, 1986; Tamaoki, 1994; Ramarine, 1996; Федин, 2001]. Эти воспалительные изменения усиливаются за счет афферентной импульсации С-волокон, активирующей нейроны функционального модуля, которые контролируют функцию ГМ ДП, микрососудистого русла и железистых клеток эпителия. Усиление выхода ацетилхолина (АХ) из эфферентных нейронов приводит к гиперактивности ГМ бронхов, выходу экссудата из микрососудов и гиперсекреции. АХ активирует также иммунокомпетентные клетки, в частности, тучные клетки, а выделяемый ими гистамин дополнительно стимулирует чувствительные терминали. КС взаимодействуют с рецепторами капсаицин-чувствительных С-волокон, препятствуя воздействию на них раздражающего агента и запуску нейрогенного воспаления. Таким образом, ПВ эффект КС может реализовываться не только за счет геномного механизма, но и нейрогенного (негеномного).

Влияние фенспирида на сократительную активность бронхов в процессе формирования ХОБЛ. Для определения точки приложения действия фенспирида было исследовано его влияние на сократительную реакцию бронхов. Предварительная обработка препаратов бронхов новокаином устраняла дилатацию бронхов, вызванную низкими концентрациями фенспирида (1 и 10 мкг/мл), и существенно уменьшала эффект фенспирида в дозе 100 мкг/мл – с 41,0(3,8 % до 26,4(9,0 % (р<0,05).

После ежедневного (на протяжении 60 дней ингаляций NO2) применения фенспирида в дозе 15 мг/кг (суточная доза для человека с учетом межвидового пересчета) величина сокращения ГМ бронхов крыс в ответ на контрольную стимуляцию ПГН и самой ГМ была ниже, чем у крыс без лечения (183,2 ± 17,2 против 237,9 ± 24,5 мг, р<0,05) и не отличалась от интактных животных. При использовании фенспирида в дозе 0,15 мг/кг сократительный ответ ГМ бронхов на контрольную стимуляцию ПГН не отличался от такового у крыс без лечения. Если у нелеченных животных дополнительная стимуляция ПГН усиливала сокращения ГМ бронхов, то на фоне низкой дозы фенспирида усиления сократительной активности ГМ не отмечалось, а при использовании терапевтической дозы амплитуда сокращения ГМ бронхов была меньше, чем у интактных крыс (78,2±4,7 %, р<0,05). При дополнительных стимуляциях самой ГМ амплитуды сокращения не различались после применения обеих доз фенспирида и были достоверно меньше, чем в группе без лечения и у интактных животных.

Т.о., при использовании низкой дозы фенспирида его дилатационный эффект опосредован, главным образом, взаимодействием с окончаниями афферентных С-волокон бронхов, при использовании терапевтической дозы – с окончаниями С-волокон и, в основном, непосредственно с ГМ бронхов. Это согласуется с результатами Girard (1997), который показал, что фенспирид в концентрации <10-4M уменьшает выброс тахикининов из сенсорных окончаний на пресинаптическом уровне. В более высоких концентрациях (>10-4M) проявляется постсинаптическое действие фенспирида непосредственно на ГМ бронхов. Фенспирид в терапевтической дозе сильнее, чем П расслаблял ГМ бронхов как интактных животных, так и крыс, подвергнутых воздействию NO2. Морфологическое исследование легких крыс, получавших низкую дозу фенспирида, выявило практически нормальную воздушность легочной ткани, редко встречалась незначительная клеточная инфильтрация. Отсутствовали выраженные структурные повреждения, характерные для животных с ХОБЛ. Применение низкой дозы фенспирида препятствовало развитию воспалительных изменений в легочной ткани под влиянием ингаляционного воздействия NO2. Это могло быть обусловлено взаимодействием фенспирида с рецепторами С-волокон, что не только способствовало проявлению бронхолитического эффекта, но и препятствовало инициации нейрогенного воспаления. Терапевтическая доза фенспирида влияла непосредственно на ГМ бронхов. Бронхолитический эффект применения терапевтической дозы фенспирида был подтвержден гистологически – просвет бронхов был расширен, уменьшилось число бокаловидных клеток. Однако в просветах большинства альвеол выявлялись серозная жидкость и частично гемолизированные эритроциты (кровоизлияния разных сроков давности). Воспалительные изменения, характеризовавшиеся экссудацией и пролиферацией клеток лимфоцитарно-макрофагального звена, выявлялись только в интерстициальной ткани легких. Морфологические изменения, характерные для развития ХОБЛ, отсутствовали. Полученные результаты позволяют считать фенспирид перспективным для разработки схем, предупреждающих развитие ХОБЛ. Особое значение имеет установленный факт, что для профилактики этого заболевания может быть использована доза фенспирида значительно меньше терапевтической. Это делает возможным длительное применение препарата у лиц, имеющих контакт с агрессивными ингаляционными факторами (поллютанты, сигаретный дым).

Итак, раздражение рецепторов С-волокон NO2 вызывает развитие воспалительных изменений, обусловленных нейрогенными механизмами. Васкулярные нарушения возникают одновременно с запуском нейрогенных механизмов воспаления и прогрессируют по мере его развития, приводя на ранних этапах к расстройствам легочной МЦ, а на более поздних – к повышению давления в МКК (рис. 21).

Рис. 21. Схема участия нейрогенных факторов в развитии сосудистых изменений при формировании ХОБЛ.

NK ( нейрокининовые рецепторы, KGRP ( кальцитонин-ген родственный пептид, SP – субстанция Р, TXА2 – тромбоксан А2.

Выделение тахикининов и эфферентная функция блуждающего нерва (БН) способствуют развитию вазоконстрикции и ЛГ. Активация вазоконстрикторых факторов на начальных этапах развития ХОБЛ частично нивелируется за счет компенсаторного синтеза вазодилататоров. При далеко зашедшем патологическом процессе основную роль в развитии ЛГ начинает играть мощный сосудосуживающий фактор ЕТ-1. До тех пор пока можно оказывать влияние на рецепторы С-волокон (начальные стадии ХОБЛ), состояние сосудов МКК может в определенной степени контролироваться. Это частично объясняет положительный эффект применяемого ИГКС и фенспирида у больных со среднетяжелым течением ХОБЛ, т.к. эти препараты, взаимодействуя с сенсорными терминалями С-волокон, препятствуют выделению нейромедиаторов, инициации воспалительных изменений и формированию васкулярных нарушений.

Таким образом, возникновение сосудистых изменений в легких на ранних стадиях ХОБЛ реализуется преимущественно за счет нейрогенных механизмов воспаления. Клеточные и молекулярные факторы начинают оказывать существенное влияние на васкулярные процессы на этапе дальнейшего прогрессирования заболевания, когда в легочной ткани эффект нейрогенных механизмов, инициирующих ХОБЛ, сводится на нет. Это опосредует также дополнительный негеномный механизм КС-рефрактерности, обусловленный инактивацией рецепторов С-волокон.

Поэтому у пациентов с 3 ст. ХОБЛ клинический эффект на фоне лечения ИГКС значительно меньше, чем у больных 2 ст. заболевания: редуцируется возможность влияния на сосудистые процессы. Это, в конечном итоге, определяет терапевтический прогноз при назначении ИГКС и подтверждается построенной математической моделью.

Одним из основных патогенетических механизмов формирования хронического воспаления при ХОБЛ является значительное нарастание уровня провоспалительных цитокинов и отсутствие компенсаторного увеличения содержания ПВ цитокинов как в очаге воспаления, так и на системном уровне.

Отсутствие параллелизма в изменении концентрации цитокинов в очаге воспаления и в сыворотке крови у пациентов с разной степенью тяжести ХОБЛ может свидетельствовать о независимом течении локального и системного воспаления.

Установлено значение генотипа ММР-1 1G/1G как фактора повышенного риска развития ЛГ и генотипов ММР-3 5А/5А, ММР-1 2G/2G и 5-НТТ S как факторов формирования ТБД при ХОБЛ.

Полиморфизм гена АСЕ можно рассматривать как модификатор клинических проявлений ХОБЛ. Выявлена роль генотипа АСЕ D как фактора высокого риска развития системной ДЭ; генотип D/D ассоциирован с высоким риском смертности среди лиц мужского пола в среднем и старшем возрастах.

Выявлена роль генетического фактора, регулирующего транспорт и захват серотонина (гиперактивный аллель L гена 5-НТТ), в развитии ДН у больных ХОБЛ, что может быть обусловлено усилением дисфункции гладкомышечных структур сосудов и бронхов.

При развитии ХОБЛ выявляется раннее повреждение сосудистого звена, в значительной степени опосредуемое нейрогенными механизмами: увеличивается концентрация ЕТ-1 в периферической крови, нарушается легочная МЦ, повышается уровень СДЛА.

Установлено, что формирование ХОБЛ в эксперименте происходит вследствие взаимодействия NO2 с афферентными капсаицин-чувствительными волокнами ДП, что подтверждает роль нейрогенного воспаления в развитии этого заболевания. На ранних этапах развития ХОБЛ гиперреактивность бронхов связана, главным образом, с нарушением работы нейронов функционального модуля: его афферентного звена и М2-холинорецепторов постганглионарных холинергических нервов, регулирующих выделение АХ; на поздних этапах – со снижением сократительной активности мышц ДП.

На модели ХОБЛ доказано, что КС в терапевтических дозах вызывают дилатацию ГМ бронхов, однако по мере прогрессирования воспаления этот эффект уменьшается, вплоть до полного его исчезновения вследствие инактивации афферентных окончаний С-волокон NO2. На поздних стадиях формирования патологии КС оказывают бронхоконстрикторное действие вследствие непосредственного влияния на гладкие мышцы ДП.

Лечение крыс ингаляционными КС на поздней стадии развития модели ХОБЛ оказывает положительное влияние на сократительные свойства гладких мышц ДП, но не препятствует прогрессирующему ухудшению функции нервных структур бронхов.

Выраженность положительного клинического эффекта при назначении ПВ препаратов у больных ХОБЛ зависит от степени оптимизации легочной МЦ на фоне проводимой терапии.

Разработана модель прогноза эффективности терапии ИГКС, согласно которой прогностическими критериями являются уровень Hb, величина СДЛА и размер ПЖд сердца.

Доказано, что фенспирид по своему влиянию на клиническое течение и микроциркуляторную дисфункцию легких больных ХОБЛ менее эффективен, чем ИГКС. Однако лечение фенспиридом позволяет достигнуть улучшения по некоторым шкалам, характеризующим КЖ больных.

Противовоспалительный препарат фенспирид в терапевтической дозе обладает более выраженным, чем преднизолон дилатационным действием на изолированные препараты бронхов крыс с ХОБЛ. Низкие дозы фенспирида (в 100 раз меньше терапевтических) взаимодействуют, главным образом, с нервными окончаниями С-волокон, терапевтические дозы – с нервными окончаниями С-волокон и с мышцами бронхов.

Применение низких доз фенспирида препятствует развитию воспаления в бронхолегочной системе при 15-ти дневной ингаляции NO2, а при 60-ти дневной ингаляции в легких крыс выявляется только начальная фаза воспалительного процесса (без морфологических изменений). Терапевтическая доза фенспирида защищает крыс от развития ХОБЛ на протяжении любого срока воздействия NO2, приводя к формированию патологического процесса иного характера.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В связи с развитием КС-рефрактерности по мере прогрессирования ХОБЛ, раннее назначение ИГКС оказывает положительное влияние на течение заболевания.

Эффективность ИГКС у больных ХОБЛ может быть определена с большой степенью вероятности до их назначения на основе следующих показателей: уровня Hb, СДЛА, ПЖд сердца. Предложенные показатели доступны для практических ЛПУ и необременительны для пациента.

На ранних стадиях ХОБЛ в схему лечения необходимо включать фенспирид, т.к. помимо патогенетического лечебного воздействия препарат может замедлять прогрессирование заболевания даже при условии продолжающегося влияния агрессивных ингаляционных факторов.

С целью оптимизации ведения больных ХОБЛ у всех пациентов мужского пола необходимо определять функциональный вариант I/D гена АСЕ-1, т.к. генотип D/D способствует высокому кардиоваскулярному риску и существенному снижению выживаемости.

Для оценки функционального состояния эндотелия в клинической практике следует использовать метод УЗ диагностики сосудодвигательной функции плечевой артерии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


загрузка...