Видеоцифровая регистрация для иммунологических и биохимических исследований в практике клинической лабораторной диагностики (01.03.2010)

Автор: Старовойтова Татьяна Авенировна

А. Применение комплекса «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов твердофазного иммуноферментного анализа в 96-луночных микропланшетах.

Разработанный нами аппаратно-программный комплекс «Эксперт-Лаб» с ПО «Эксперт-Лаб ИФА» может быть с использован в качестве вертикального фотометра для микропланшетов при проведении ИФА. Он не уступает по характеристикам высококлассным фотометрам с расширенными опционными возможностями. Оценка характеристик регистрации результатов ИФА с применением комплекса «Эксперт Лаб» была проведена в сопоставлении с данными анализатора «VICTOR 1420» («Wallac», Финляндия) при длине волны 450 нм. Воспроизводимость двух систем сопоставлялась при многократных измерениях набора фильтров КПА-01 для метрологической поверки вертикальных фотометров. Полученные коэффициенты вариации во всем диапазоне оптических плотностей для обоих приборов не превышали 1%.

Следующим этапом работы являлась апробация аппаратно-программного комплекса для обычных задач ИФА в КДЛ. На рис. 5. представлены данные измерений значений ОП модельного планшета, полученные с помощью аппаратно-программного комплекса «Эксперт-Лаб» и на анализаторе «VICTOR 1420». Очевидно полное совпадение результатов в диапазоне оптических плотностей от 0 до 3 оптических единиц (коэффициент корреляции по Спирмену – 0,999). При значениях оптических плотностей выше 3,0 прибор «VICTOR» выходит за паспортный предел измерений, который для него составляет 3,0, а сканер позволяет измерять и такие значения оптической плотности.

Количественные методы лабораторных измерений подразумевают построение калибровочной кривой и определение по ней концентрации аналитов. Программа «Эксперт-Лаб ИФА» позволяет вводить значения калибраторов, строить калибровочную кривую и определять значения концентраций исследуемых веществ. Для применяемых в лабораторной практике вариантов количественных определений ИФА были проведены сопоставления значений концентраций для различных схем постановки реакций.

Рис. 5. Сравнение значений ОП, полученных с помощью разработанного нами аппаратно-программного комплекса «Эксперт-Лаб» и на анализаторе «VICTOR 1420».

Данные сопоставительных исследований приведены в таблице 2. Уравнения регрессии и коэффициенты корреляции для различных типов иммуноферментных реакций: количественный конкурентный (свободный тироксин, трийодтиронин, ДЕА-S), количественный «сэндвич» (антитела к ТПО и ТГ, ТТГ), качественный с определением «cut off» (антитела к Chlamidia trachomatis класса G, HBsAg) демонстрируют статистическую неразличимость данных, полученных с помощью двух систем регистрации.

Предлагаемое для сканерной системы ПО дает возможность разных вариантов обсчета и представления получаемой информации во всех режимах измерения (оптические плотности, вариант «cut off», измерение концентраций). Программа обеспечивает удобную предварительную разметку планшета, гибкие варианты распечаток.

Таблица 2. Статистическая проверка сопоставимости концентраций аналитов, измеренных на фотометре и сканере.

Аналит Уравнение Регрессии Коэффициент Корреляции

Антитела к ТПО y = 1,0274x -2,6629 0,968

Антитела к ТГ y = 0,9994x -0,7105 0,843

ТТГ y =1,0016x +0,0521 0,999

Свободный тироксин y = 1,0047x -0,3034 0,995

Трийодтиронин y = 0,9917x-0,4691 0,942

ДЕА-S y = 1,1354x -0,1163 0,998

Антитела к Chlamidia trachomatis класса G y = 0,9117x+0,1691 0,999

HbsAg y = 0,8919x+0,171 0,999

На основе анализа изображения лунок для ПО «Эксперт-Лаб ИФА» разработана опция автоматического выявления лунок, имеющих неоднородную окраску, которые отмечаются в итоговом протоколе анализа. Эта уникальная функция, принципиально недоступная для обычных фотометров, дает возможность выявить неправильные измерения, часто имеющие место, например, для гиперактивных образцов, измерение которых приводит к выпадению субстрата в осадок из-за повреждений поверхности лунок и других ошибок проведения ИФА определений. Применение функции выявления лунок с негомогенной окраской показано на рис. 6.

Рис. 6. Пример выявления лунок с негомогенной окраской с помощью ПО «Эксперт-Лаб ИФА» (увеличенное изображение и выделение лунки А12 с неоднородной структурой).

Кроме того, сканерная система позволяет сохранять первичное изображение планшета, что обеспечивает ретроспективный контроль для любых спорных, требующих повторного анализа, ситуаций.

Таким образом, полученные результаты показывают, что аппаратно-программный комплекс «Эксперт-Лаб» с соответствующим ПО может использоваться в качестве вертикального фотометра, причем предоставляет пользователю ряд преимуществ, принципиально недоступных для обычных фотометров.

Б. Применение комплекса «Эксперт-Лаб» для оценки результатов реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакции агглютинации желатиновых частиц.

Для регистрация результатов реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) разработка алгоритмов ПО («Эксперт-Лаб РПГА») проводилась по экспериментальным данным, полученным при применении трепонемных эритроцитарных диагностикумов для скрининга наличия антител к Treponema pallidum.

Основное окно программы построено по описанному выше принципу с представлением сохраняемого первичного изображения, расчетных оценок интенсивности реакции в каждой лунке, данных автоматической интерпретации результата реакции для каждого образца. Предусмотрена опция вывода на экран увеличенных изображений любых лунок, обеспечивающая возможность более объективного заключения о прохождении реакции.

Для изучения характеристик разработанной системы регистрации результатов РПГА было исследовано 9964 сыворотки, из них 381 образец (3,8%) имел положительный результат РПГА, 75 образцов (0,75%) были сомнительными.

Наличие численной оценки интенсивности реакции на основании рассчитанных целевых значений позволяет вести контроль качества. Для этого использовали лиофилизированную сыворотку (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск), выпускаемую для внутрилабораторного контроля качества. На рис. 7 приведен пример контрольной карты. Для расчета CV и построения контрольной карты вычисляли коэффициент позитивности (КП ? интенсивность агглютинации пробы/интенсивность агглютинации отрицательного контроля). Целевые значения составили: Хср = 3.1, SD = 0.57, CV20 = 18%.

Рис. 7. Контрольная карта для определения антител к Tr.pallidum методом РПГА с ВЦР, построенная на основе числовой оценки интенсивности реакции.

Сравнение визуального и инструментального учета результатов РПГА разработанной системой показало высокий уровень корреляции получаемых результатов (R Cпирмена 0,999, р =0,00005).

Были проведены эксперименты по сопоставлению автоматического учета и оценки результатов четырьмя опытными операторами, которые продемонстрировали субъективность при визуальном учете результатов РПГА. Процент расхождений оценок операторов при визуальной оценке РПГА составил от 2% (отрицательные результаты) до 47% (результаты +/?). В отличие от визуальной оценки, программа «Эксперт-Лаб РПГА» полностью формализует представление результатов степени выраженности агглютинации, не меняющихся при повторных оценках планшетов, то есть позволяет объективизировать учет результатов.

Для регистрации результатов реакции агглютинации желатиновых частиц был разработан вариант программного обеспечения «Эксперт-Лаб Serodia» и продемонстрирована возможность использования этой модификации программы для тест-систем на основе сенсибилизированных желатиновых частиц фирмы «Serodia» для определения антител к вирусу гепатита С, ВИЧ 1 и 2, антител к Tr.pallidum (ТРРА), РФ, АСЛО, антистрептокиназы. Для таких и аналогичных тест-систем также важна объективизация результатов анализа.

На рис. 8 в качестве примера показаны лунки с положительными, сомнительными и отрицательными результатами реакции агглютинации при исследовании на антитела к Tr.pallidum, к HCV.

???????»?ь

???????»

???????»

???????»

um, HCV в тестах агглютинации желатиновых частиц фирмы «Serodia».

Для проверки совпадения результатов РПГА и ТРРА с применением ВЦР было параллельно исследовано 46 положительных и 46 отрицательных проб. Обработка результатов привела к регрессионной кривой: RPGA = 1,3381 + 0,94618 * Serodia, R Спирмена 0,93, что подтверждает соответствие результатов двух этих методов.

В. Применение и характеристики комплекса «Эксперт-Лаб» для оценки результатов реакции латексной агглютинации.

Исследования латексной агглютинации в формате 96-луночного планшета проводили на прозрачных крышках 96-луночного планшета, где лунки отделены друг от друга бортиками (фирмы “Costar”, США). Стандартный способ проведения реакции латексной агглютинации (ЛА) подразумевает использование непрозрачных карточек со специальными реакционными полями, на которых смешивается по 50 мкл латексного реагента и исследуемого образца, результат оценивается визуально через 2-3 минуты. Для ВЦР с комплексом «Эксперт-Лаб» использовалось измерение в режиме пропускания с проведением реакции в крышках планшетов. Расход реагентов и сывороток при этом составлял не более 10 мкл, то есть снизился в 4-5 раз по сравнению со стандартной методикой. Полученное первичное изображение всей крышки сохраняется в памяти компьютера и служит основой для последующих цифровых операций с конкретными «зонами интереса» (контрастирование, увеличение, математическая обработка). Основное рабочее окно программы «Эксперт-Лаб Агглютинация» показано ранее на рис.3.

В качестве модели для оценки характеристик реакции ЛА с видеоцифровой регистрацией было выбрано определение СРБ, РФ и АСЛО. На рис. 9 показаны увеличенные изображения лунок с наличием агглютинации при определении СРБ, РФ, АСЛО, причем видно, что морфология конгломератов различается для разных латексов.


загрузка...