Видеоцифровая регистрация для иммунологических и биохимических исследований в практике клинической лабораторной диагностики (01.03.2010)

Автор: Старовойтова Татьяна Авенировна

5. Сконструировать приспособления формирования матриц микрокапель на планарных носителях и создать полные аналитические системы, включающие эти приспособления и программно-аппаратные комплексы для регистрации и интерпретации результатов иммунологических и биохимических исследований в микроматричном формате.

6. Провести расширенную апробацию разработанных методов и аппаратуры на клиническом материале в сопоставлении с референсными лабораторными системами и подготовить научно обоснованную методическую базу для внедрения этих методов в практику клинической лабораторной диагностики.

Научная новизна работы

Разработана не имеющая аналогов многофункциональная система регистрации результатов иммунологических исследований на основе сканера.

Впервые разработано программное обеспечение для регистрации результатов латекс - агглютинационных исследований на планарных носителях с количественной оценкой реакций для любых латекс -агглютинационных тестов.

С применением разработанных подходов видеоцифровой регистрации и микрометодов предложены новые, эффективные варианты проведения серийных исследований латексной агглютинации, изосерологических тестов в различных форматах, позволяющие снизить необходимые для анализов объемы реагентов и проб в 10-30 раз.

Разработана, защищенная патентом РФ, полная аналитическая система для проведения матричных дот - иммунологических и биохимических анализов в микро - формате, включающая приспособления нанесения микрокапель образцов и реагентов на планарные носители, видеоанализатор и специализированное программное обеспечение.

Практическая ценность работы

Разработана лабораторная многофункциональная регистрирующая система «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов латекс - и гемагглютинационных исследований, иммунохроматографических тестов, иммуноферментного анализа. Эта универсальная видеоцифровая система с пакетом программ «Эксперт-Лаб» (Свидетельство о регистрации № 2007613095 в Реестре программ для ЭВМ от 20.07.2007) может рассматриваться как основной лабораторный комплекс, обеспечивающий регистрацию результатов практически всего спектра иммунологических исследований.

За разработку и внедрение системы комплекса «Эксперт-Лаб» присужден Диплом биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2007» (Москва, 2007). Разработка видеоцифровых систем для лабораторной диагностики отмечена золотой медалью «Международного салона инноваций и инвестиций» (Москва, 2009).

На основе разработанного аналитического комплекса для матричных дот - иммунологических и биохимических анализов в микроформате с видеоцифровой регистрацией предложены методы серийного дот - анализа альбумина в моче, глюкозы крови, латексагглютинационного метода определения содержания аналитов ревматоидной тройки (СРБ, РФ, АСЛО) и изосерологических исследований, позволяющие в десятки раз снизить объемы реагентов и проб и повысить производительность.

Внедрение результатов работы

Разработанная лабораторная система «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов латекс - и гемагглютинационных исследований, иммунохроматографических тестов, иммуноферментного анализа внедрена в серийное производство на предприятии ОАО «ЛОМО» (Санкт-Петербург) (Регистрационное удостоверение № ФС 02012006/3617-06 от 10.08.2006). Системы «Эксперт-Лаб» используются в учебном процессе кафедры клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в практике работы КДЛ ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова», НУЗ «ЦКБ №1 ОАО «РЖД», ГУЗ «Московский областной перинатальный центр», ГУЗ ДЦ №1 УЗ ЮЗАО.

Положения, выносимые на защиту

Разработанные и научно обоснованные подходы усовершенствования лабораторных методов с видеоцифровой регистрацией реализованы и внедрены в практику в виде многофункциональных программно-аппаратных комплексов, обеспечивающих получение объективных и достоверных результатов широкого спектра биохимических и иммунологических лабораторных исследований.

На основе сочетания подходов видеоцифровой регистрации и применения микрометодов создана и реализована в виде полного аналитического комплекса технология проведения биохимических и иммунохимических исследований в матричных форматах в микрообъемах реагентов и образцов.

Использование разработанных видеоцифровых систем регистрации результатов иммунологических и биохимических исследований повышает качество и достоверность лабораторных данных за счет объективизации их оценки, сохранения первичного документа теста для ретроспективного контроля.

Личный вклад автора

Автор лично принимала участие в определении направлений, планировании и выполнении исследований: разрабатывала медицинские требования к приборным и аппаратным компонентам программно-аппаратных комплексов и приспособлений для проведения исследований в микроформатах, критерии для алгоритмов регистрации и дискриминации результатов иммунологических исследований, осуществляла оценку разработанных лабораторных методов в сопоставлении с референсными вариантами, сформулировала рекомендации для использования результатов исследований в клинико-диагностических лабораториях.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались на совместной научно-практической конференции кафедры клинической лабораторной диагностики ФУВ и проблемной научно-исследовательской лаборатории нуклеинового и белкового обмена ГОУ ВПО РГМУ Росздрава 06 октября 2009года.

Печатные работы

По теме диссертации опубликовано 19 публикаций в отечественной и зарубежной печати, из них в изданиях, рекомендуемых ВАК- 9 работ. Получены патент на изобретение №2325644 от 27.05.2008 и свидетельство №2007613095 «Пакет программ для лаборатории «Эксперт-Лаб» от 20.07.2007.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 163 стр., состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, практических рекомендаций, списка литературы, списка сокращений. Список литературы содержит 149 работ, из которых 44 отечественные источники. В диссертационную работу включены 11 таблиц и 48 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Контрольные материалы, образцы мочи, крови и сывороток были предоставлены ООО «КДЛ - тест» г. Москвы (всего более 12 000 образцов от 8860 пациентов, проходивших плановое или динамическое обследование).

Изображения аналитических объектов (96-луночных плоскодонных и круглодонных микропланшетов, разработанных микропланшетов формата 3х4, матричных объектов формата 5х6) в режиме светопропускания получали с помощью сканера «Epson Perfection-4990 Photo» («Epson», Япония), а изображения матричных дот-объектов и иммунохроматографических тест-полосок в режиме отражения получали как с помощью сканера, так и с использованием рефлектометра «Рефлеком» (ООО «Синтэко-Комплекс», Россия.)

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с видеоцифровой регистрацией на наличие антител к Treponema pallidum было исследовано 9964 образца сыворотки. 96 проб параллельно тестировались в реакции Treponema pallidum particle agglutination (TPPA).

Аналитические характеристики программно-аппаратного комплекса при регистрации результатов иммуноферментного анализа (ИФА) исследованы на 1317 образцах сывороток (определение антител к ТПО и ТГ, ТТГ, общего ПСА, свободного тироксина, трийодтиронина, ДЕА-S, антител к Chlamidia trachomatis класса G, HBsAg). При постановке иммунологических реакций применяли коммерческие тест-системы.

Для разработки технологии проведения реакции латекс -агглютинации (ЛА) и изосерологических исследований в формате 8х12 с видеоцифровой регистрацией результатов было отобрано 460 сывороток пациентов с известным содержанием СРБ, РФ, АСЛО и 201 образец цельной крови с установленной группой крови соответственно.

Для формирования матриц микрокапель исследуемых образцов или реагентов на планарных носителях использовали разработанные нами аппликаторы со стальными пинами различной толщины.

Серийный анализ глюкозы методом «сухой химии» проводили, нанося на мембрану «Меридиан» (фирма «NDP», Австралия), помещенную на специальный носитель, образцы сыворотки крови с помощью разработанного 30-пинового аппликатора.

Серийное определение альбумина в моче проводили, нанося 30-пиновым аппликатором образцы мочи пациентов на нитроцеллюлозную мембрану «Schleicher & Schull» (Германия). После блокировки мембраны в растворе сухого молока проводили реакцию с генноинженерным рецептором или моноклональными антителами к альбумину, конъюгированными с пероксидазой хрена. Затем мембраны промывали буфером и помещали в субстратную смесь, содержащую диаминобензидин. Для калибровки применяли мочу с добавлением известных количеств сухого альбумина человека.

Серийные исследования факторов ревматоидной тройки (СРБ, РФ, АСЛО) проводили, используя латексные реагенты «BioScience» (Франция), «BioSystems» (Испания). 30-пиновым аппликатором забирали микрокапли (0,3-0,5 мкл) латексной суспензии и образцов двукратных разведений тестируемой сыворотки и контролей из соответствующих микропланшетов. С помощью системы позиционирования-смешивания помещали их последовательно на носитель в виде упорядоченной матрицы точек и перемешивали. Контроль воспроизводимости и чувствительности разработанных методов осуществляли с помощью контрольных сывороточных аттестованных образцов фирмы «Randox» и «DiaSis».

Оценку аналитических характеристик матричных микрометодов определения: - аналитов ревматоидной тройки в тестах ЛА производили в ходе исследований 119 образцов сыворотки крови, - концентрации глюкозы в сыворотке и цельной крови при исследованиях 340 образцов и 37 образцов соответственно, - серийного определения содержания альбумина в моче в ходе исследований 67 образцов.

Серийные и мультиплексные исследования групп крови проводились с цоликлонами анти-А, анти-В и анти-D-супер фирмы «Медиклон» (Россия). Суспензию эритроцитов (или образцы крови) и цоликлоны (исследуемые сыворотки и стандартные эритроциты – для перекрестного метода) аппликаторами наносили на стекло и перемешивали.

Иммунохроматографические тесты для определения простатического специфического антигена (ПСА) различных фирм («Alfa Scientific Design» США, Medical» ЮАР и др.) использовали в сочетании с разработанной системой видеорегистрации. В качестве образцов для иммунохроматографического определения ПСА использовали 207 сывороток крови пациентов с заболеваниями предстательной железы, проходивших обследование по городской программе скрининга мужчин старше 40 лет, а также 169 сывороток здоровых мужчин.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы«STATISTICA-6 for WINDOWS» и MS Exell с учетом характера распределения и применением параметрических и непараметрических критериев.


загрузка...